Die quantitative PCR (qPCR), auch als Real-Time-PCR bezeichnet, ist eine molekularbiologische Methode zur quantitativen Messung der Menge spezifischer DNA- oder RNA-Sequenzen in einer Probe. Sie basiert auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), bei der ein bestimmter Abschnitt der DNA vervielfältigt wird. Im Gegensatz zur klassischen PCR ermöglicht die qPCR jedoch die Echtzeit-Beobachtung und quantifizierung der Amplifikation während des Prozesses, was eine genaue Bestimmung der Ausgangsmenge der Ziel-DNA erlaubt.

Die qPCR wird häufig in der Biologie, Medizin, Diagnostik und Umweltwissenschaften eingesetzt, etwa zur Analyse von Genexpression, zur quantitativen Detektion von Krankheitserregern oder zur Identifikation genetischer Mutationen. Ihre hohe Empfindlichkeit und Spezifität ermöglichen es, selbst kleinste Mengen von Nukleinsäuren nachzuweisen und deren Konzentration exakt zu bestimmen. Die Methode beruht auf der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszenzmarkierten Sonden, die es erlauben, den Fortschritt der Reaktion kontinuierlich zu überwachen und die Menge an amplifizierter DNA in Echtzeit zu messen.

Für die Durchführung einer qPCR wird die zu analysierende Nukleinsäure zunächst extrahiert und aufgereinigt. Soll RNA quantifiziert werden, wie es bei der Analyse der Genexpression häufig der Fall ist, wird sie vor der qPCR in einem Zwischenschritt durch eine Reverse Transkription in cDNA umgeschrieben. Anschließend erfolgt die Amplifikation in einem qPCR-Gerät, das die Temperaturzyklen der PCR (Denaturierung, Annealing und Elongation) durchführt und gleichzeitig die fluoreszenzbedingten Signaländerungen misst. Es gibt zwei Hauptarten der qPCR-Methoden: Die Verwendung von DNA-bindenden Farbstoffen wie SYBR Green, die unspezifisch an jede doppelsträngige DNA binden, und die Verwendung von Sonden (z.B. TaqMan-Sonden), die spezifisch an die Zielsequenz binden und nur bei deren Amplifikation fluoreszieren. Während Farbstoff-basierte Methoden kostengünstiger sind, bieten Sonden-basierte Ansätze eine höhere Spezifität.

Der quantitative Aspekt der qPCR ergibt sich daraus, dass die Fluoreszenzintensität in jeder Zyklusphase gemessen wird, was eine direkte Beziehung zur Menge der DNA in der Probe herstellt. In den frühen Phasen der PCR-Amplifikation bleibt die Fluoreszenzintensität niedrig. Erst wenn die Menge an vervielfältigter DNA einen bestimmten Schwellenwert erreicht – der sogenannte Ct-Wert (cycle threshold) – wird ein signifikanter Anstieg der Fluoreszenz messbar. Der Ct-Wert ist dabei invers proportional zur Ausgangsmenge der Zielsequenz: Je niedriger der Ct-Wert, desto höher war die ursprüngliche Menge an DNA oder RNA in der Probe. Durch die Erstellung einer Standardkurve mit bekannten Konzentrationen der Zielsequenz lässt sich die Ausgangsmenge der DNA exakt bestimmen.

In der medizinischen Diagnostik wird die qPCR zur schnellen und genauen Identifizierung von Infektionserregern wie Viren oder Bakterien genutzt. Während der COVID-19-Pandemie wurde die Methode vielfach zur Diagnose des SARS-CoV-2-Virus eingesetzt, da sie auch geringe Viruslasten im Frühstadium einer Infektion erkennen kann. In der Onkologie wird die qPCR zur Analyse von Tumorgenexpressionsprofilen und Mutationen in bestimmten Genen verwendet. Zudem spielt sie eine wichtige Rolle in der genetischen Forschung, etwa bei der Untersuchung von Genexpression in Zellen und Geweben oder bei der Analyse genetischer Polymorphismen und Mutationen.

Die hohe Präzision der qPCR und die Fähigkeit zur Echtzeit-Messung bieten viele Vorteile, jedoch hat die Methode auch Einschränkungen. So können Inhibitoren in der Probe die Effizienz der Amplifikation beeinträchtigen und zu ungenauen Ergebnissen führen. Die korrekte Interpretation der Daten erfordert außerdem eine sorgfältige Kalibrierung und die Erstellung einer Standardkurve, insbesondere bei der quantitativen Analyse von unbekannten Proben. Trotz dieser Herausforderungen hat sich die qPCR als unverzichtbares Werkzeug in der molekularen Biologie und Diagnostik etabliert, das eine schnelle, präzise und quantifizierbare Analyse von Nukleinsäuren erlaubt und so wertvolle Einblicke in biologische Prozesse und Krankheitsmechanismen ermöglicht.